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關于層析柱裝柱、使用及相關注意事項

更新時間:2011-06-06  |  點擊率:12677

 

關于層析柱裝柱、使用及相關注意事項
(1)、裝柱前要仔細看填料的使用說明書,每種填料都有自己的特性,以及特殊的裝柱方法,針對不同的空柱,也要注意方法可能不同;
3、這一點非常重要:裝柱包括以后使用中不允許柱內進入氣泡(bubble free),柱頭事先也要排除氣泡。
(2)、填料要加水攪拌成均勻懸液,懸液濃度依填料而不同,一般70-85%,迅速倒入空柱內,或吸或壓,流速和具體步驟看說明書。
(3)、所有柱子盡量做到填料均勻,尤其是用于凝膠層析的柱子。裝柱完成后,可用柱效測定的方法檢查裝填效果。一個裝填合格的柱子的理論塔板高度應是填料平均粒徑的2-4 倍,在此范圍內越小越好。
(4)、選擇合適的泵,**是流速滿足要求,脈沖盡量小。柱塞泵。
(5)、準備上柱的液體應進行過濾,至少是0.45micrometre。
(6)、關于純化,**要考慮的是你的目標:純度、數量、速度、收率等等,再根據樣品的具體情況,尤其是目標蛋白的性質,確定純化策略。通常三步曲:capture、purification、polishing。*步先從大量或復雜樣品中將目標蛋白%26ldquo;抓出%26rdquo;,與主要雜質分離;再用高選擇性的層析去除絕大部分雜質;后精細純化,提供純度至設定目標。到實際工作中,不要死靠三步,也許一步也許四步或更多,具體情況具體分析。所謂%26ldquo;三步%26rdquo;只是一種思路而已。
(7)、至于測序,我想大概不到1mg 應該足夠了。
常壓反相硅膠柱的使用注意事項
C18反相硅膠的預處理很簡單,就是用甲醇浸泡即可。上海五相儀器對其使用作如下說明:使用的時候,將C18反相硅膠用甲醇混勻,攪拌,可以稍微超聲脫氣泡但不可時間太長,5分鐘吧。然后勻漿裝柱,用甲醇沖洗柱子2-3個柱體積,將C18中的交聯劑之類洗掉,然后用你的洗脫劑沖洗主子2-3個柱體積。洗脫劑的選擇可以根據液相也可以根據反相板。如果根據液相的話,需要將液相條件中的有機相減小10%作為洗脫劑為好。然后將你的帶分離物質用洗脫劑溶解,上樣,加洗脫劑沖就可以了。反相硅膠可以反復使用,使用次數增多以后,有可能在柱子頂端產生顏色很深的色帶,可以選擇用丙酮沖洗,如果洗不掉可以選擇將其挖去,然后將主子內C18硅膠保存在甲醇中即可。注意不要甲醇干了。




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