層析柱是凝膠層析技術中的主體，一般用玻璃管或有機玻璃管。層析柱的直徑大小不影響分離度，樣品用量大，可加大柱的直徑，一般制備用凝膠柱，直徑大于2厘米，但在加樣時應將樣品均勻分布于凝膠柱床面上。分離度取決于柱高，為分離不同組分，凝膠柱床必須有適宜的高度，分離度與柱高的平方根相關，但由于軟凝膠柱過高擠壓變形阻塞，一般不超過1米。層析柱濾板下的死體積應盡可能的小，如果支掌濾板下的死體積大，被分離組分之間重新混合的可能性就大，其結果是影響洗脫峰形，出現拖尾出象降低分辯力。在分離時，死體積不能超過總床體積的1/1000。
        凝膠過濾層析是利用一定大小孔隙的具有網狀結構的凝膠作層析介質（如葡聚糖凝膠、瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠等），根據被分離物質的分子大小、形狀不同擴散到凝膠孔隙內的速度不同，因而通過層析柱的快慢不同而分離的一種層析法。
         層析柱的分離原理是根據物質在硅膠上的吸附力不同而使各組分分離。一般情況下極性較大的物質易被硅膠吸附，極性較弱的物質不易被硅膠吸附。當采用溶劑洗脫時，發生一系列吸附、解吸、再吸附、再解吸的過程，吸附力較強的組分，移動的距離小，后出柱；吸附力較弱的組分，移動的距離大，先出柱。